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2020-07-23基于多组分含量测定和化学计量学的风寒感冒颗粒整体质量评价研

 要:目的  建立一种超高效液相色谱(UHPLC-UV)波长切换法同时测定风寒感冒颗粒中D-苦杏仁苷、葛根素、橙皮苷等14种化学成分的含量,结合化学计量学分析不同来源样品的质量差异。方法  色谱柱为Agilent Poroshell 120 EC-C18150 mm×2.1 mm,2.7 μm),以乙腈-0。1%磷酸水溶液为流动相梯度洗脱,切换波长(210254310 nm)对5家生产企业68批样品中14种化学成分含量进行测定;并使用雷达图分析、相似度评价、热图聚类分析和主成分分析法对数据进行统计分析。结果  68批样品中各成分质量分数分别为D-苦杏仁苷0。0633.885 mg/g3′-羟基葛根素0.0121.540 mg/g、葛根素0。0364.017 mg/g3′-甲氧基葛根素0.0161.837 mg/g、葛根素-6″-O-木糖苷0.0040。449 mg/g、芹糖葛根素苷0。0212。076 mg/g、大豆苷0.0101.527 mg/g、升麻素苷0。0070.471 mg/g5-O-甲基维斯阿米醇苷0.0621.029 mg/g、橙皮苷0.2108。453 mg/g、迷迭香酸0.0010.237 mg/g、水合氧化前胡素0.0070。204 mg/g、甘草酸0。0561。311 mg/g、氧化前胡素0。0020。042 mg/g。化学计量学分析表明,同一厂家不同批次样品的整体质量一致性较好,但不同厂家之间样品的整体质量一致性存在较大差异。结论  建立的基于UHPLC波长切换法的多组分含量测定方法简便、重复性好、专属性强,可为风寒感冒颗粒的整体质量评控提供方法参考。
 

风寒感冒颗粒源于经典名方麻黄汤,由麻黄、葛根、紫苏叶、防风、桂枝、白芷、陈皮、苦杏仁、桔梗、甘草、干姜11味中药组方而成,具有解表发汗、疏风散寒的功效,用于治疗风寒感冒身热、头痛、咳嗽等症。该药现行质控标准主要是《卫生部药品标准》中药成方制剂第一册(标准中原名“风寒感冒冲剂”),标准的整体质控力较弱,仅有性状、制剂通则检查项[1],缺少薄层鉴别和含量测定等质控方法。风寒感冒颗粒的生产企业较多,不同厂家、不同批次之间的整体质量和一致性评价至今尚无文献报道。目前其质控研究主要集中在盐酸麻黄碱、葛根素、橙皮苷、升麻素苷等1个或2个成分含量测定[2-4],检测指标少,难以有效控制风寒感冒颗粒的整体质量。通过文献调研,本研究选择D-苦杏仁苷[5]、葛根素[6-8]、升麻素苷[9]、橙皮苷[10-11]、迷迭香酸[12]、甘草酸铵[13]14个主要药味的特征化学成分作为指标,对风寒感冒颗粒的整体质量进行多组分化学评价。所选14个化学成分涵盖方中苦杏仁、葛根、防风、陈皮、紫苏叶、白芷、甘草7味药材,且药理活性与风寒感冒颗粒的临床应用有直接关联,这些化学成分的含量高低能在一定程度上反映风寒感冒颗粒的整体质量情况。由于选择的14个待测化学成分的最大吸收波长差异较大,不能在同一波长下同时测定,为兼顾各化学成分的最大吸收波长,提高灵敏度,减少干扰,本实验采用UHPLC波长切换法对市场占有率较高的5家生产企业的68批次样品进行含量测定,并进行化学计量学分析,以期能为风寒感冒颗粒的整体质量评控和标准修订提供一些参考。

1  仪器与试药

1.1  仪器

Thermo 3000超高效液相色谱仪,配备二极管阵列检测器,美国赛默飞世尔科技公司;Thomovanquish UHPLC串联Q Exactiveplus四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱,美国赛默飞世尔科技公司;XPE26百万分之一电子天平,瑞士Mettler Toledo公司;AE-240十万分之一电子天平,德国赛多利斯公司;SK250H超声仪,50kHz,上海科导超声仪器北京赛车pk10投注;10100 μL移液枪,德国Eppendorf公司;Milli-Q超纯水制备系统,美国Millipore公司。

1.2  试药

对照品葛根素(批号110752-201816,质量分数95.4%)、大豆苷(批号111738-201603,质量分数93.3%)、升麻素苷(批号111522-201712,质量分数96.2%)、5-O-甲基维斯阿米醇苷(批号111523-201811,质量分数97.4%)、迷迭香酸(批号111871-201706,质量分数90.5%)、甘草酸铵(批号110731-201720,质量分数97.7%)、橙皮苷(批号110721-201818,质量分数96.2%)、大豆苷元(批号111502-200402)由中国食品药品检定研究院提供;对照品D-苦杏仁苷(批号18032611,质量分数98.0%)由成都普菲德生物技术北京赛车pk10投注提供;对照品3′-羟基葛根素(批号MUST-19041601,质量分数99.59%)、3′-甲氧基葛根素(批号MUST-19041602,质量分数98.47%)、葛根素-6″-O-木糖苷(批号MUST-19052801,质量分数99.45%)、芹糖葛根素苷(批号MUST-19022203,质量分数99.41%)、水合氧化前胡素(批号MUST-19022202,质量分数99.95%)、氧化前胡素(批号MUST-19022201,质量分数98.04%)、川陈皮素(批号MUST-18042205,质量分数98.86%)由成都曼斯特生物科技北京赛车pk10投注提供。

色谱级甲醇、色谱级乙腈、质谱级甲酸,美国Fisher公司;色谱级磷酸,天津市科密欧化学试剂北京赛车pk10投注;分析纯甲醇、乙醇等试剂购自广东光华科技股份北京赛车pk10投注;水为超纯水。

1.3  样品

68批次风寒感冒颗粒样品来自5个生产企业,信息见表1

 

 

2  方法与结果

2.1  色谱质谱条件

2.1.1  色谱条件 色谱柱为AgilentPoroshell 120 EC-C18150 mm×2.1mm2.7 μm);以乙腈(A0.1%磷酸水溶液(B)为流动相,梯度洗脱程序为032 min,2%14% A3257 min14%18% A5780 min18%50% A;体积流量为0.3mL/min;柱温为25 ℃;检测波长:020 min254 nm2022 min210 nm2245 min254 nm4558 min210 nm5861 min330 nm6180 min254 nm;进样量为5 μL。UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析过程以0.1%甲酸水溶液为流动相B,其余条件同上。

2.1.2  质谱条件 离子源为HESI-II源;离子传输管温度320 ℃,辅助气温度350 ℃,辅助气压力10 arb,鞘气压力35 arb,喷雾电压3.50 kV。扫描方式:正离子Full MS/dd-MS2模式,Full MS分辨率为70 000 FWHMdd-MS2分辨率为17 500 FWHM,质荷比窗口宽度为m/z 1,碰撞能梯度为204060 eV,扫描范围为m/z1001 500

2.2  溶液的制备

2.2.1  混合对照品溶液的制备  D-苦杏仁苷、3′-羟基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素-6″- O-木糖苷、芹糖葛根素苷、大豆苷、升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、橙皮苷、迷迭香酸、水合氧化前胡素、甘草酸铵、氧化前胡素对照品适量,精密称定,加50%甲醇制成含D-苦杏仁苷429.1 μg/mL3′-羟基葛根素235.8 μg/mL、葛根素341.4 μg/mL3′-甲氧基葛根素154.6μg/mL、葛根素-6″-O-木糖苷51.5 μg/mL、芹糖葛根素苷218.3 μg/mL、大豆苷233.3 μg/mL、升麻素苷46.9 μg/mL5-O-甲基维斯阿米醇苷97.2 μg/mL、橙皮苷313.2 μg/mL、迷迭香酸28.5 μg/mL、水合氧化前胡素44.9 μg/mL、甘草酸铵293.1 μg/mL、氧化前胡素11.7 μg/mL的混合对照品溶液。

2.2.2  供试品溶液的制备  取风寒感冒颗粒粉末4.0 g,精密称定,置锥形瓶中,准确加入甲醇50 mL,称定质量,超声提取30min,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,精密吸取续滤液5 mL,挥干,残渣用50%甲醇溶解,并转移至5 mL量瓶中,稀释至刻度,摇匀,用0.22 μm微孔滤膜滤过,取续滤液,即得。

2.3  方法学考察

2.3.1  线性范围考察  精密吸取“2.2.1”项下混合对照品溶液,稀释制得系列不同质量浓度的混合对照品溶液。按照“2.1.1”项色谱条件依次进样,记录色谱峰面积。以峰面积为纵坐标,化合物质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,进行线性回归,结果见表2。结果表明,各成分在各自质量浓度范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

2.3.2  精密度试验  取“2.2.1”项下混合对照品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件连续进样6次,记录峰面积,计算RSD。结果显示,14种待测化学成分峰面积的RSD1.09%2.28%,表明仪器精密度良好。

2.3.3  稳定性试验  取同一供试品溶液(S1),分别在048121624 h进样测定,记录峰面积并计算RSD,结果显示,14种待测化学成分峰面积的RSD0.30%2.81%,表明供试品溶液在制备后24h内基本稳定。

2.3.4  重复性试验  取同一批样品(S1),按“2.2.2”项下方法,平行制备6份供试品溶液,按“2.1”项下色谱条件进行检测,计算各成分含量。结果显示,14种待测化学成分质量分数的RSD0.24%2.93%,表明该测定方法重复性良好。

2.3.5  加样回收率试验  精密称取已知含量的样品粉末(S19份,每份取样量为供试品溶液制备时取样量的50%,以当前取样含量的0.51.01.5倍,分别精密加入混合对照品溶液,按“2.2.2”项方法制备供试品溶液,按含量测定方法测定,计算加样回收率。结果显示,14种待测化学成分的平均加样回收率为95.24%100.00%RSD1.18%2.92%。表明该方法具有良好的准确度,方法可行。

2.4  样品含量测定

按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.1.1”项下色谱条件进样5 μL分析,计算各成分含量。典型的色谱图见图1,含量测定结果见表3。

 

为了更直观地反映各生产企业样品中化学成分的含量分布情况,绘制了14种化学成分的平均含量分布情况雷达图。由于不同化学成分的含量差异较大,将5个生产企业样品中14种化学成分含量平均值分别进行加和,再以各生产企业每种化学成分的含量平均值与相应总和比较,得到比值,用比值绘制雷达图,结果见图2。结果显示,各化学成分含量比值的落点几乎没有重合,而且落点分布广,表明同一化学成分在不同企业样品中的差异较大。企业A的整体轮廓较大,说明该企业样品中14种化学成分含量均较高,提示质量可能较好;而企业E的整体轮廓明显小于其他企业,说明该企业样品中14种化学成分含量均偏低,提示从多组分化学含量高低的角度来评价该企业样品质量可能不佳。以D-苦杏仁苷为例,D-苦杏仁苷为苦杏仁中平喘止咳的主要活性成分[5],企业A样品中的平均含量是企业E样品中平均含量的28.5倍(3。591 mg/g vs 0.126 mg/g),且5个不同生产企业样品中D-苦杏仁苷的含量差异较大,这是值得关注的。
2.5  化学计量学统计分析

2.5.1  指纹图谱相似度评价及特征图谱的构建  指纹图谱能更全面地反映中成药中各种化学成分的整体分布情况,尤其是在现阶段有效成分绝大多数尚不明确的情况下[14-15]。将68批不同生产企业风寒感冒颗粒UHPLC-UV图谱,导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》,与参照谱图(整体色谱丰度较高的ABCD 4家生产企业样品UHPLC-UV图谱生成)比较相似度,相似度分析结果见表4。结果显示,ABCD 4家生产企业的风寒感冒颗粒样品相似度大于0.940,表明这些批次样品间的整体差异性较小;而企业E样品相似度在0.8560.983,表明与其他企业相比,企业E的样品整体质量差异较大。但含量测定结果表明,不同生产企业的样品之间14个化学成分的含量存在一定差异,经查阅文献报道[16-17],可能是不同样品指纹图谱没有色谱峰缺失和增加,仅存在峰面积大小差异,而不同化学成分峰面积差异较大,高达数百倍,大峰掩盖小峰信息所致。

含量测定结果表明不同生产企业风寒感冒颗粒化学成分含量差异较大,整体质量评控难度大。因此在多成分含量测定的基础上,进一步建立了风寒感冒颗粒的特征指纹图谱,以期为风寒感冒颗粒质量的整体评控提供参考。将整体色谱丰度较高的46批次(不含E厂家22批次)风寒感冒颗粒的UHPLC- UV谱图数据,导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)》,以S1为参照谱图(在46批次样品的色谱图中峰度相对较高),经多点校正后,进行色谱峰的匹配,生成特征指纹图谱。采用对照品比对和UHPLC-Q-Exactive- Orbitrap HRMS技术对25个共有峰进行指认,其中16个色谱峰经对照品比对确证,6个色谱峰经过高分辨质谱指认,构建的典型风寒感冒颗粒特征指纹图谱见图3。经高分辨质谱分析但未经对照品比对色谱峰离子碎片信息见表5

2.5.2  热图聚类分析  为了更直观地展示不同企业生产的风寒感冒颗粒的多组分化学差异性,以测得的68批次样品中14种化学成分的含量作为评价指标,采用HemI-1.0软件以欧氏距离、远邻法进行热图聚类分析,结果见图4。其中横向聚类样品,纵向聚类成分含量,热图颜色条带的变化体现各成分的含量高低。热图分析结果显示不同生产企业中14种化学成分的含量差异较大。其中生产企业A各成分条带颜色偏暖,表明其所含各成分含量均较高,其产品质量较好;而生产企业E各成分条带颜色均偏冷,表明其所含各成分含量均较低,其产品质量较差,与雷达图分析结果一致。不同生产企业聚类分析结果显示68批次样品总体聚类区分较明显,各企业样品各自聚为一类,表明同一生产企业的样品质量一致性较好而不同生产企业的样品间的质量一致性较差。成分聚类结果显示C3C10聚为一类,C1单独聚为一类,其他成分聚为一类,表明C1D-苦杏仁苷)、C3(葛根素)、C10(橙皮苷)为区分各样品的主要成分。

2.5.3  主成分分析(principal component analysis,PCA PCA可对复杂信息中的多变量进行快速提取、降维分析,通过降维可排除众多化学信息中相互重叠的信息,生成新的综合变量即主成分,经投影处理后,样本最终落在主成分组成平面上的位置,即可表征不同样本的总体信息[23-25]。本研究以68批次风寒感冒颗粒中14种化学成分含量为变量,采用多元变量统计软件 SIMCA 14.1进行PCA。分析结果显示,贡献率最大的3个主成分,累积方差贡献率超过90%,表明前3个主成分能够充分体现出风寒感冒颗粒的基本特征和主要信息。模型R2X0.963Q20.911,表明模型拟合效果较好,结果见图56。

由图5可知,各生产企业样品出现明显的分类,PCA的整体区分与热图聚类分析结果一致;企业B样品分布相对较分散,提示其不同批次之间的质量存在一定的差异。图6主成分载荷图,表示每个化学成分对主成分综合作用的贡献,每1个点代表1个化学成分,距离载荷图原点越远的变量,权重越大,代表该化合物的含量对样本区分起的作用就越大。载荷图中橙皮苷(C10)、D-苦杏仁苷(C1)在坐标系中的绝对值较大,表明这2个成分是区分不同生产企业风寒感冒颗粒的重要指标,与热图聚类分析结果一致。橙皮苷是陈皮的指标性成分,具有增强毛细血管韧性、缩短出血时间等药理活性[10-11];目前,市场流通环节的陈皮来源混杂,茶枝柑、大红袍、朱橘、温州蜜桔、福橘等数十个柑橘品种或品系的成熟果皮均作陈皮使用,且产地、加工方式、储藏时间等不同,导致药材中橙皮苷含量差异显著,提示生产企业应关注陈皮投料药材的质量一致性。D-苦杏仁苷是苦杏仁止咳平喘的主要活性成分,易异构化为L-苦杏仁苷,且在一定的温度和湿度条件下易被水解为葡萄糖、氢氰酸和苯甲醛,导致D-苦杏仁苷含量差异较大,提示生产企业应关注苦杏仁投料的原药材质量及提取工艺对D-苦杏仁苷的影响。

3  讨论

课题组前期到生产企业实地调研,发现不同生产企业用于投料的原药材来源、大生产过程中的工艺参数(如加水量、挥发油提取方式及提取时间、制成总量)、生产设备等存在较大差异。本实验研究结果表明,同一企业不同批次样品的整体质量一致性(化学一致性)相对较好,但不同企业之间样品的整体质量一致性差异较大,这值得监管部门和企业的关注。

中成药化学成分复杂,仅仅测定少数几个指标性成分很难全面反映中成药的整体质量差异,多组分化学表征有利于其整体质量评控。通过文献调研,本研究建立了风寒感冒颗粒处方中7味药味14种化学成分的同时定量分析方法,以评价风寒感冒颗粒整体质量。课题组曾尝试同时测定君药麻黄的指标性成分盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱,但由于化学性质差异较大,分离度及峰型较差,不能满足测定条件,故采用水蒸气蒸馏法对其进行单独测定。测定结果显示5家不同生产企业的风寒感冒颗粒中盐酸麻黄碱和盐酸伪麻黄碱总量均值规律为C0.545 mg/g)>A0.519 mg/g)>B0.436 mg/g)>D0.211 mg/g)>E0.100 mg/g),生产企业E二者总量仅为生产企业C18.34%。

本实验建立了基于UHPLC波长切换法的风寒感冒颗粒中14种化学成分的同时定量分析方法,并对市场流通环节收集的5个生产企业的68批样品进行测定,具较强的代表性和较广的覆盖面。通过雷达图、指纹图谱相似度评价、热图聚类分析和PCA等化学计量学综合评价了不同生产企业样品的整体质量情况,为风寒感冒颗粒的质量评控提供了客观数据和参考方法。

参考文献(略) 

来  源: 许  莉,黄晓婧,高  鹏,赵小勤,文永盛,谭  鹏.基于多组分含量测定和化学计量学的风寒感冒颗粒整体质量评价研究 [J]. 中草药, 2020, 51(14):3670-3679.

 

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